背景
凋亡诱导因子(AIF)被证明是未成熟脑缺氧缺血(HI)后神经元丢失的主要原因。事实上，携带亚型突变基因的小鼠由于AIF表达减少而对HI脑损伤有保护作用。为了进一步研究这种神经保护作用可能的分子机制，作者在rosa26位点引入了标记的编码AIF蛋白的潜在转基因，然后通过普遍表达的Cre重组酶对其进行条件激活，从而产生了一只AIF敲入小鼠。结果显示，过表达AIF的TG小鼠加剧了新生鼠HI后脑损伤(包括灰质和白质)，这个发现证实了早期研究表明的AIF在新生儿HI性脑损伤中起关键作用。
结果
01
过表达AIF的TG小鼠具有正常生理功能
AIF有两种表型，体内普遍存在的AIF1型和脑内特异性的AIF2型。以往的研究发现，AIF2的缺乏会加重新生儿HI损伤。相反，在相同的条件下，降低AIF1的表达可以减少神经细胞的丢失。因此，作者用RT-qPCR检测出生后第9天（P9）的鼠发现，转基因鼠中AIF1mRNA是WT鼠中的5.9倍，而两者的AIF2型无显著变化。同样地，WB结果显示，与WT对照相比，AIFTG小鼠体内检测到两条AIF蛋白条带，上层为带有标志标签的转基因AIF(FLAG-AIF)，分子量较高，与内源性AIF有明显区别，下层为内源性AIF。P9天时，AIFTG小鼠的总AIF蛋白丰度是WT小鼠的2.4倍，其他的线粒体相关蛋白则均无显著差异。作者还评估了AIFTG小鼠的体重和脑组织氧化磷酸化水平与WT小鼠的差别，结果仍无显著差异。在小鼠1岁时作者检测海马齿状回颗粒层发现，由神经元前体细胞表达的一种微管相关蛋白——神经元增殖标记物Doublecortin(DCX)，AIFTG小鼠中DCX阳性细胞远超WT小鼠。这些结果提示过量的AIF可能会在长期内促进神经元的增殖，但不会影响早期阶段的脑部发育。
图1：在生理条件下P9天的AIFTG小鼠线粒体相关蛋白的表达
（a）整个研究的时间表。（b）AIFTG小鼠较WT小鼠在P9时Aif1mRNA表达显著上调。（c）WT和AIFTG小鼠在P9时Aif2mRNA表达无显著性差异。（d）P9时WT和AIFTG小鼠大脑皮质线粒体的WB图。在AIFTG小鼠中，外源性AIF(AIF的上带)比内源性AIF(AIF的下带)的数量更多。（e）AIFTG小鼠(两条带)的总AIF蛋白表达明显高于WT小鼠(一条带)，而内源性AIF蛋白表达则无显著差异。（f）4种线粒体相关蛋白在WT和AIFTG小鼠之间没有显著差异。（g）P9时WT和AIFTG小鼠大脑皮质线粒体部分的OXPHOS复合体I活性测定结果无显著性差异。（h）P9时，WT和AIFTG小鼠体重无显著差异。（i）1岁时，WT和AIFTG小鼠体重无显著差异。（j）1岁时，AIFTG小鼠齿状回颗粒层DCX阳性细胞密度明显高于WT小鼠。（k）WT和AIFTG小鼠1岁时齿状回DCX染色的代表性图片。黑色箭头表示阳性细胞。
为了进一步研究在生理条件下AIF过表达是否对mRNA转录组有影响，作者用RNA测序的方法测定了6个P9雄性小鼠大脑皮质组织的转录本，并用基因本体论（GO）对差异基因进行分类。结果显示，AIF过表达对P9小鼠大脑皮层转录组无明显影响。
图2：AIF过表达对P9小鼠大脑皮层转录组无明显影响
（a）火山图显示WT和AIFTG雄性小鼠(n=6只/组)之间存在差异。未显著表达的基因用灰色绘制。显著上调和下调的基因分别用红色和蓝色绘制(总共21,个基因中有个基因上调，个基因上调，个基因下调)。（b）在三个本体论中排名前十的GO分类术语。根据DEGS(共个基因)进行GO分类。X轴表示DEG数，Y轴表示GO项。
02
AIF过表达加重新生鼠缺氧缺血性脑损伤
在P9小鼠HI造模72h后，作者用免疫组化对脑组织切片染色。脑冠状切片MAP2染色显示，脑损伤涉及皮质、海马、纹状体和丘脑，AIF过表达显著增加了HI后脑损伤的严重程度。具体包括AIFTG小鼠相对于WT小鼠，其脑梗死体积显示的灰质损伤增加了74.6%、神经病理评分增高、皮质下白质内可见髓鞘形成以及同侧半球内皮质下白质丢失体积显著升高。虽然AIF过表达增加了HI后脑损伤严重程度，但AIFTG小鼠组内脑损伤程度无性别差异。
图3：AIF过表达使HI后脑损伤加剧
（a）WT和AIFTG小鼠HI后72h在背侧海马(左侧板)和纹状体(右侧板)冠状面MAP2的染色图。（b）WT和AIFTG小鼠在HI后72h测量梗死体积。（c）在HI后72h对WT和AIFTG小鼠进行总病理评分。（d）对WT和AIFTG小鼠不同脑区的病理评分进行了评估，包括皮质（Cx）、海马（Hip）、纹状体（Str）和丘脑（Tha）。（e）代表性的脑冠状切片MBP染色显示，HI后72h，CL和IL半球皮质下白质内可见髓鞘结构。（f）对皮质下白质(SWM)组织损失率的量化显示，在HI后72小时，AIFTG小鼠比WT小鼠有更多的白质丢失。
03
AIF过表达影响凋亡细胞死亡途径
与成人大脑相比，未成熟脑细胞凋亡趋势增强主要以caspase依赖和非依赖两种方式。因此，对这两条通路的抑制可以缓解HI后脑损伤的严重程度。AIF是caspase非依赖途径中的一个重要物质，本实验显示HI后24h，部分脑区AIF核移位明显增加。AIF染色结果显示，AIFTG小鼠大脑皮质的AIF阳性核数量是WT小鼠的3倍，海马CA1区AIF阳性核数量是WT小鼠的1.8倍，纹状体的AIF阳性核数量是WT小鼠的1.3倍，缰核的AIF阳性核数量是WT小鼠的3.1倍。
为了阐明外源AIF的核转位，用能够识别转基因编码的AIF蛋白(标记有FLAG?肽序列)的FLAG抗体进行免疫染色。免疫荧光染色结果证实，外源性AIF参与了HI诱导的细胞核移位和凋亡细胞死亡。
图4：AIF过表达增加HI后脑内的AIF核转位
（a）AIF染色的全景图像显示WT和AIFTG小鼠在HI后24小时的皮层和海马。（b）高倍镜下的AIF染色图像显示WT和AIFTG小鼠HI后24h，Cx区(上面板)和海马CA1区的AIF阳性核(下面板)。（c）HI后24h，WT和AIFTG小鼠Cx区和海马CA1区AIF阳性细胞核的定量。（d）高倍率AIF染色图像显示WT和AIFTG小鼠HI后24h，Str(上面板)和缰核(HN)(下面板)的AIF阳性核。（e）HI后24h，WT和AIFTG小鼠Str区和HN区AIF阳性细胞核的定量。（f）皮质FLAG染色显示外源性AIF在TG小鼠中有表达，而在WT小鼠(左面板，WT-CL和TG-CL)中未见表达，外源性AIF的核移位(右面板，WT-IL和TG-IL)。（g）免疫荧光染色AIF(绿色)和FLAG(红色)显示HI后24h内源性和外源性AIF均有核移位(白色箭头表示损伤细胞，红色箭头表示正常细胞)。
Caspase依赖的凋亡细胞死亡途径，作者采用免疫组化法检测HI24后不同脑区的caspase-3活性变化。结果显示，在皮质（1.6倍）和纹状体（1.2倍）内，AIFTG小鼠相比于WT小鼠，caspase-3阳性细胞数量明显增多，而在海马CA1或缰核内，两者无显著变化。说明相比于caspase-3依赖途径，在海马CA1和缰核中，caspase-3非依赖途径更加明显。
作者还发现，同侧大脑皮质caspase-3活性升高，但WT和AIFTG小鼠间无显著差异。WB检测HI后24h多聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP-1)的表达。与对侧（CL）脑比较，同侧（IL）脑裂解PARP-1表达显著增加，而WT和AIFTG小鼠之间的表达无明显差异。
图5：HI脑损伤后，AIF过表达增加了部分小鼠脑内活跃的caspase-3阳性细胞
（a）HI后24h，WT和AIFTG小鼠大脑Cx和Str的caspase-3染色。（b）高倍镜下的caspase-3染色图像显示WT和AIFTG小鼠在HI后24h的Cx(上面板)和海马CA1区(下面板)有caspase-3阳性细胞。（c）HI后24hWT和AIFTG小鼠大脑Cx、CA1区caspase-3阳性细胞的定量。（d）高倍镜下的caspase-3染色图像显示WT和AIFTG小鼠在HI后24h的Str(上面板)和HN(下面板)有caspase-3阳性细胞。（e）HI后24hWT和AIFTG小鼠大脑Str、HN区caspase-3阳性细胞的定量。（f）HI脑损伤后24h检测Cx中caspase-3活性。WT和AIFTG小鼠IL半球的酶活性显著升高，但差异无显著性。（g）WB检测WT和AIFTG小鼠HI后24hCL和IL半球Cx中PARP-1和裂解PARP-1的表达。以LaminB作为载药对照。（h）WT和AIFTG小鼠的PARP-1和裂解PARP-1的定量结果显示两者没有明显差异。
04
HI脑损伤后AIF过表达对线粒体相关蛋白无明显影响
为了研究HI后AIF过表达对线粒体细胞死亡相关蛋白的影响，作者在HI后24h用WB检测皮质中线粒体总AIF、FLAG-AIF、CHCHD4、COX1、SOD2和CYTC的蛋白表达。结果显示，WT和AIFTG小鼠的CL和IL相比，IL的AIF蛋白表达均下降，且该趋势在AIFTG鼠中更明显，这表明HI后线粒体中释放更多的AIF。另外，线粒体还释放约18%的转基因(FLAG阳性)AIF。剩下的4种线粒体相关蛋白在WT和AIFTG鼠中无显著差异。
作者利用RT-qPCR检测HI后24h时AIF两种表型的mRNA表达，发现在WT和AIFTG鼠中，Aif1均显著上调而Aif2均显著下调。亲环素A（CYPA）参与脑HI后神经元AIF的核移位，检测中发现，WT和AIFTG小鼠皮质细胞核中IL半球CYPA浓度显著升高，且AIFTG组小鼠升高更加显著。
图6：HI后皮质中线粒体相关蛋白的变化
（a）WB检测HI后24hWT和AIFTG小鼠CL和IL半球Cx线粒体部分AIF、FLAG、CHCHD4、COX1、SOD2和CYTC的表达。（b）HI后24hWT和AIFTG小鼠CL和IL半球线粒体AIF蛋白定量。AIFTG小鼠的IL半球中线粒体AIF的减少幅度更大。（c）AIFTG小鼠HI后24hCL和IL半球线粒体FLAG-AIF蛋白定量。AIFTG小鼠IL半球线粒体释放FLAG-AIF。（d）RT-qPCR检测HI后24hWT和AIFTG小鼠Cx中Aif1和Aif2mRNA的表达。在WT和AIFTG小鼠中，Aif1的表达均升高，Aif2的表达均降低。（e）线粒体相关蛋白(CHCHD4、COX1、SOD2和CyTC)在HI后24h，WT、AIFTG组无显著差异，但WT组和AIFTG组小鼠IL半球中CHCHD4表达均升高。（f）HI后24h，WT和AIFTG小鼠IL半球皮质细胞核CYPA含量均明显升高。这种增加在AIFTG小鼠中更为明显。
05
AIF过表达对线粒体动力学无影响
为探讨AIF过表达对线粒体动力学的影响，测定了P9时WT和AIFTG小鼠在生理条件下分裂：磷酸化动力相关蛋白1（P-DRP1)、线粒体分裂蛋白1（FIS1）和融合相关蛋白：OPA1线粒体动力蛋白样GTPase（OPA1）和线粒体融合蛋白1（MFN1）的表达，并于HI后24h时进一步检测P-DRP1和FIS1的表达。结果发现，在P9时，以上蛋白在WT和AIFTG小鼠中无显著差异。在HI后24h时，P-DRP1和FIS1的表达不仅在不同脑半球无显著差异，在WT和AIFTF鼠中也无显著差异。短型和裂解带OPA1在IL半球呈显著上升趋势，而MFN1在IL半球呈显著下降趋势，长型OPA1则无显著变化。OPA1短型和裂解产物增加，MFN1减少，提示HI脑损伤后线粒体融合受损。然而，WT和AIFTG小鼠在OPA1的切割和MFN1的耗竭方面没有差异。提示AIF过表达所致的新生鼠HI脑损伤加重不太可能与线粒体动力学改变有关。
图7：AIF过表达对大脑皮层线粒体分裂和融合的影响
（a）生理条件下P9时WT和AIFTG小鼠大脑皮质线粒体部分P-DRP1和FIS1的免疫印迹，且两蛋白的定量结果显示WT和AIFTG组无显著差异。（b）生理条件下P9时WT和AIFTG小鼠大脑皮质线粒体部分MFN1和OPA1的免疫印迹，且两蛋白的定量结果显示WT和AIFTG组无显著差异。（c）HI后24h，WT和AIFTG小鼠大脑CL和IL半球皮质线粒体部分P-DRP1和FIS1的免疫印迹，且定量结果显示CL和IL半球间及WT和AIFTG组间均无显著差异。（d）HI后24h，WT和AIFTG小鼠大脑CL和IL半球皮质线粒体部分MFN1和OPA1的免疫印迹。在WT和AIFTG小鼠中，MFN1均显著下降而OPA1的短型和裂解带则显著升高，这些变化均无组间差异。
总结
研究表明，过量的AIF不会引起明显的表型改变或任何生理功能的改变，但体外实验证实了：AIF过表达确实加重了新生鼠HI后脑损伤。这与线粒体AIF核转位的增加以及部分脑区caspase-3活性增加有关。为未来的研究提供了新的策略：抑制HI脑损伤后线粒体AIF释放和随后的核移位。
撰文：金蔚
排版：金蔚
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