于群1赵慧2王炳琪1陈怀龙2张文博3王海鹏2王明山2时飞2
1潍坊医学院麻醉学院，潍坊；2青岛大医院麻醉科，青岛；3医院麻醉科，烟台
国际麻醉学与复苏杂志,,43(02):-.
DOI：10./cma.j.cn-?
基金项目
青岛市民生科技计划项目（19?6?1?50?nsh）
ORIGINALARTICLES
本研究拟通过观察PTPIP51对线粒体?内质网结构偶联（MAMs）的影响，探讨其在N2a细胞氧糖剥夺/复糖复氧（OGD/R）损伤中的作用。
1材料与方法
将指数生长的N2a细胞株置于37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱内培养至细胞密度达70%，按照随机数字表法分为4组：对照组（C组）、氧糖剥夺/复糖复氧组（OGD/R组）、干扰小RNA（siRNA）?PTPIP51转染组（siRNA组）、siRNA?NC转染组（NC组）。OGD/R模型制备：将N2a细胞高糖培养液换成低糖培养液，置于37℃、5%CO2、95%N2缺氧环境中培养3h后重新置于高糖培养液中正常条件下培养。C组继续在正常条件下培养；OGD/R组仅制备OGD/R模型；siRNA组与NC组在OGD/R模型制备前48h分别转染siRNA?PTPIP51及siRNA?NC，余同OGD/R组。各组于复糖复氧12h、24h后收集细胞检测。细胞计数试剂盒（CCK?8）法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡率，实时荧光定量PCR（RT?qPCR）检测PTPIP51mRNA表达水平，Westernblot检测PTPIP51蛋白水平，共聚焦显微镜观察线粒体?内质网共定位水平。
2结果
2.1 各组N2a细胞存活率、凋亡率比较
组间比较：与C组比较，其他3组细胞存活率降低（P0.05）、细胞凋亡率升高（P0.05）；与OGD/R组、NC组比较，siRNA组细胞存活率升高（P0.05）、细胞凋亡率降低（P0.05）。组内比较：与12h比较，OGD/R组、siRNA组、NC组24h细胞存活率降低（P0.05）、细胞凋亡率升高（P0.05）。见表1。
2.2 各组N2a细胞PTPIP51mRNA相对表达量与蛋白水平比较
组间比较：与C组比较，其他3组细胞PTPIP51mRNA相对表达量和蛋白水平升高（P0.05）；与OGD/R组、NC组比较，siRNA组细胞PTPIP51mRNA相对表达量和蛋白水平降低（P0.05）。组内比较：与12h比较，OGD/R组、siRNA组、NC组24h细胞PTPIP51mRNA相对表达量和蛋白水平升高（P0.05）。见图1、表2。
2.3 各组N2a细胞线粒体?内质网共定位系数比较
组间比较：与C组比较，其他3组细胞线粒体?内质网共定位系数升高（P0.05）；与OGD/R组、NC组比较，siRNA组细胞线粒体?内质网共定位系数降低（P0.05）。组内比较：与12h比较，OGD/R组、siRNA组、NC组24h细胞线粒体?内质网共定位系数差异无统计学意义（P0.05）。见图2、表3。
3讨论
本研究通过建立N2a细胞OGD/R模型，模拟在体脑缺血/再灌注损伤的过程。结果显示，OGD/R组细胞胞质回缩、细胞数量减少、细胞存活率降低、细胞凋亡率升高，提示N2a细胞OGD/R模型建立成功。本研究选择在细胞处理前转染siRNA?PTPIP51，siRNA组处理后PTPIP51表达降低、细胞数量增多、细胞存活率升高、细胞凋亡率下降，提示经siRNA?PTPIP51处理后脑保护效应模型建立成功。
本研究结果显示，与C组比较，其他3组细胞线粒体?内质网共定位水平升高、细胞存活率降低、细胞凋亡率升高，与OGD/R组比较，siRNA组线粒体?内质网共定位水平降低、细胞存活率增加、细胞凋亡率降低，提示MAMs结构改变是N2a细胞OGD/R损伤的机制之一。
本实验研究结果表明，与OGD/R组比较，siRNA组细胞PTPIP51mRNA及其蛋白水平降低、线粒体?内质网共定位水平降低，细胞存活率增加，细胞凋亡率降低，这提示PTPIP51是调节MAMs稳定性的关键蛋白，抑制PTPIP51表达可使线粒体?内质网共定位水平降低，可能通过减轻线粒体内钙超载来减轻细胞凋亡。
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