脑卒中是目前全球第二大致死性疾病，且致残率最高。神经保护剂对脑卒中患者的恢复有重要作用。复方脑肽节苷脂注射液
(CompoundPorcineCerebrosideandGangliosideInjection,CPCGI)是一复方制剂，其主要成分为多肽、多种神经节苷脂、次黄嘌呤等。临床研究显示，CPCGI对阿尔茨海默病有明显改善作用，并可用于脑缺血等脑部疾病引起的功能障碍的治疗。但其药理作用机制有待进一步探讨。
缺血再灌注损伤是脑卒中重要的病理生理机制之一，而线粒体功能障碍在此过程中发挥着重要作用。由于神经元的正常生理活动依赖于线粒体产生的ATP作为能量供体，调控并维持线粒体的正常功能对神经系统功能的执行至关重要。本研究采用大鼠大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型，从改善线粒体功能方面对CPCGI的抗脑缺血再灌注损伤机制进行药效学评价。
材料和方法
试剂
CPCGI银杏叶提取物注射液(金纳多)：中豪国际有限公司。
硅胶线栓：北京西浓科技有限公司。
戊巴比妥钠：SIGMA公司。
小鼠抗Parkin抗体、兔抗Beclin1抗体：CST公司。兔抗PINK1抗体：SANTACRUZ公司。
小鼠抗β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠二抗及辣根酶标记山羊抗兔二抗：北京中杉金桥生物技术有限公司。Westernblotting实验相关材料：北京普利莱生物技术有限公司。
实验动物及分组
健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量~g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，质量合格证号SCXK(军)-。SPF级环境饲养，光照12h/12h明暗交替，自由饮食。大鼠适应环境7d后，线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型。将模型制作成功的大鼠采用随机数字表法随机分成模型组、CPCGI低剂量治疗组(0.5ml/kg，相当于多肽1.6mg/kg，腹腔注射)、高剂量治疗组(1ml/kg，相当于多肽3.2mg/kg，腹腔注射)、金纳多组(50mg/kg，腹腔注射)，每组大鼠10只。各组大鼠缺血2h后再灌注即开始给药。假手术组和模型组大鼠给生理盐水1ml/kg腹腔注射。连续给药14d。
模型制备
参照Longa法[9]建立大鼠MCAO模型。术前12h禁食不禁水。大鼠1%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。备皮，碘伏消毒。沿颈正中线切开皮肤，钝性分离右侧颈部肌肉，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。结扎颈总动脉近心端及颈外动脉，在距分支5mm处用动脉夹夹闭颈总动脉远心端。在颈总动脉远心端结扎处与动脉夹之间剪一小口，插入直径0.26mm的圆头硅化栓线(用0.1%多聚赖氨酸包被)至颈内动脉，最终栓线头部膨大端进入大脑中动脉阻断血流供应。2h后小心抽出栓线。手术过程注意大鼠保温。
假手术组只进行手术过程而不插线。
行为学评价
神经功能缺损评分
各组动物分别在术后1d、3d、7d和14d进行神经功能缺损评分，包括运动、感觉、反射和平衡能力测试等。分数越高，损伤越严重。
贴纸去除实验
各组动物术后14d行贴纸去除实验。用2片边长10mm的正方形粘性纸将大鼠2个前肢掌面粘住(粘性程度以正常大鼠10s内将粘性纸咬掉为佳)，将大鼠置于测试圆筒中，大鼠会本能地将纸片咬掉。观察并记录大鼠去除两侧纸片的总时间，若s内未去除纸片，记为s。
平衡木行走实验
各组动物术后14d行平衡木行走实验[13]。平衡木为×4×3cm木条，两端固定使木条离地80cm。起始点为陡峭平台，终点为一平台。记录大鼠四肢均通过整个平衡木的时间；超过s未通过整个平衡杆记为s，大鼠从平衡杆跌落记为超过s未通过。测试前大鼠每天训练1次，共训练2d。
Westernblotting
除金纳多组外，各组动物于行为学评价结束后立即断头处死，分离脑组织，于液氮中猝冷。取损伤侧大脑皮层组织50mg左右，置于冰上的EP管中，加入10倍体积组织裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制剂∶蛋白磷酸酶抑制剂=∶1∶1)，冰浴中超声破碎仪破碎1min，充分匀浆后冰上裂解20min；4℃00r/min离心15min，取上清。Bradford法测定蛋白浓度。4∶1比例加入5×蛋白上样缓冲液，97℃变性6min，取蛋白样品50μg行SDS-PAGE电泳。80V恒压电泳至样品进入分离胶后调整为V恒压电泳，直至溴酚蓝条带接近电泳槽底部；mA恒流电转将蛋白印
迹转移到PVDF膜上；加入5%脱脂奶粉封闭1h；去除封闭液，加入稀释好的一抗(小鼠抗Parkin抗体，1∶0；兔抗PINK1抗体，1∶；兔抗Beclin1抗体，1∶0；小鼠抗β-actin抗体；1∶0)，4℃过夜；洗膜后加入稀释好的二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，1∶)，室温孵育1h；膜清洗后置于ECL发光液中显色，ECL荧光检测仪中显影。Gelpro软件灰度扫描，采用百分比归一法比较各组之间目的蛋白的表达。
统计学分析
计量数据以(xˉ±s)表示。用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析(OneWayANVOA)，两两比较采用Dunnettt检验。显著性水平α=0.05。
结果
神经功能缺损评分
假手术组无明显神经功能损伤。与假手术组相比，模型组大鼠神经功能缺损评分在术后1d、3d、7d和14d均显著增加(P0.)，各给药组大鼠经过治疗14d后，与模型组相比降低(P0.05)。见表1。
贴纸去除实验
模型组去除贴纸时间与假手术组相比显著延长(P0.)。CPCGI低、高剂量组去除贴纸时间均较模型组缩短(P0.05)。见表2。
平衡木行走实验
模型组过杆时间与假手术组大鼠相比显著延长(P0.)。CPCGI低、高剂量组，金纳多组过杆时间与模型组相比明显缩短(P0.01)。见表2
Westernblotting
模型组Beclin1的表达较假手术组明显降低(P0.01)，而CPCGI低、高剂量组均能提高其表达(P0.05)。
模型组PINK1的表达较假手术组明显升高(P0.01)，Parkin表达明显降低(P0.01)。CPCGI低、高剂量组PINK1表达较模型组降低(P0.05)，CPCGI高剂量组Parkin表达升高(P0.05)。见表3
讨论
本研究显示，CPCGI对脑缺血再灌注损伤的治疗作用与阳性药金纳多疗效相当，能促进模型大鼠的感觉功能及躯体运动协调功能的恢复。
脑缺血再灌注损伤使脑神经元内线粒体膜通透性改变及线粒体通透性转换孔开放，细胞色素C大量释放等，导致线粒体功能障碍。受损线粒体不仅无法产生足够能量供给神经元，还会生成活性氧、自由基，导致氧化损伤进一步加重。
自噬的主要功能是将胞质中一些损坏的细胞器通过溶酶体途径降解，实现能量的再循环，以维持细胞自身的稳定。Beclin1是哺乳动物细胞自噬的标记性蛋白，主要调控自噬体的形成与成熟，属特异性基因。我们检测到模型组大鼠损伤侧皮层组织蛋白中Beclin1表达显著下调，说明细胞自噬水平明显下降，经CPCGI治疗可剂量依赖地恢复Beclin1表达，使细胞恢复自噬能力。
线粒体选择性自噬机制PINK1/Parkin通路在清除受损线粒体过程中也发挥重要作用。正常情况下，PINK1表达于所有线粒体上，并由蛋白水解酶降解；而受损的线粒体由于蛋白水解酶活性被抑制，PINK1会持续累积。本研究显示，模型组大脑皮层组织中PINK1的表达显著升高，说明线粒体自噬功能障碍，CPCGI治疗可逆转这一变化。此外，Parkin参与的泛素蛋白酶体系统对于体内毒素和代谢物的清除以及细胞修复起到重要作用。本研究显示，模型组大脑皮层组织中Parkin蛋白表达降低，CPCGI则可以逆转该损伤，激活线粒体自噬，有利于清除受损线粒体，保护正常线粒体功能，从而改善缺血再灌注损伤。
综上所述，CPCGI对急性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能、感觉及运动功能均有较好的保护作用，其作用机制之一可能是通过激活线粒体自噬功能发挥的。详细作用机制尚待进一步探讨。经过小编的科普，你知道了吗？
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