缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点，严重威胁老年人身体健康和生活质量。脑缺血损伤是多机制、多信号通路网络共同参与的极为复杂的病理过程，脑缺血后一系列级联生化反应（如谷氨酸兴奋性毒性、钙离子内流、炎症反应、脑水肿、血脑屏障的损坏、细胞坏死）所引起的神经损伤[1]构成了脑缺血损伤的内在基础。
近年来发现脂质参与了脑缺血损伤/保护的诸多病理环节，其在脑缺血损伤进程中具有特殊地位。缺血性脑卒中患者往往存在胆固醇升高及磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）降低等脂质代谢紊乱症状[2]。脑缺血后磷脂酶A2激活导致溶血磷脂增加[3]，脑实质活性氧增加同样会提升溶血磷脂水平，其可加重炎症反应[4]。整体、动态、全面评价脑缺血损伤对其预后评价、药物疗效评估具有重要意义。脂质组学是对脂质进行系统分析，比较不同生理状态下脂代谢网络的变化，进而识别代谢调控中关键脂质生物标志物的新兴学科[5]，有助于从整体评价药物的作用特性。
中医药在防治缺血性脑卒中方面积累了丰富的治疗经验，丹参-川芎是用于缺血性脑卒中治疗的常用药对[6-9]，目前对其研究常在脑缺血/再灌注的整体动物、离体器官药效学层面上[10]，尚无代谢组学或脂质组学的相关报道。本研究基于脂质在脑缺血损伤中发挥的重要作用，采用超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF-MS）检测经丹参-川芎药对按《中国药典》常用量干预的局灶性脑缺血模型大鼠的血浆脂质代谢物的变化，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）法寻找潜在的脂质生物标志物，并由此探索丹参-川芎药对脑缺血损伤保护作用的机制，为新药研发及临床应用提供参考。
1材料
1.1仪器
UPLC-Q/TOF-MS：日本岛津LC-30AD超高效液相，含SIL-30AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱；美国AB/SCEIX公司ABSCEIXTripleTMTOF+飞行时间质谱，含AnalystTF1.7、PeakViewSoftware、MarkerView工作站。LGJ-12真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；TDX-1涡旋混合器（北京方通达科技有限公司）；ER台式高速低温离心机（美国Essenscien公司）；24孔氮吹仪（青岛海科科技有限公司）；V8涡旋混合器（美国Essenscien公司）；FinnpipetteF2移液枪（ThermoScientific公司）；MDFC8V?80℃超低温冰箱（日本Panasonic公司）。
1.2试药与试剂
丹参药材（广州至信药业有限公司，批号）、川芎药材（广州至信药业有限公司，批号），均由广州中医药大学张英丰副教授鉴定，分别为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎和伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎；2,6-二叔丁基-4-甲基酚（BHT，美国Sigama公司）；乙腈（色谱纯，批号QAFA1H，霍尼韦尔公司）；TTC染色试剂（Sigma公司，批号T）；实验用超纯水通过MILLI-Q系统获得。
1.3动物
清洁级雄性SD大鼠，体质量～g，广州中医药大学动物实验中心提供，生产许可证号SCXK（粤）-。
2方法
2.1丹参-川芎水煎液冻干物的制备
根据《中国药典》用量，以丹参-川芎（15∶10）的比例，取药材于mL烧杯中，去离子水浸泡15min，加水煎煮2次，加水量分别为4、3倍，时间依次为30、20min，煎好后滤过并压榨药渣。将水煎液和压榨液合并，静置、离心，吸取上清液于冷冻干燥机托盘中，?80℃预冻12h，?80℃、1Pa条件下真空冷冻干燥36h，冻干物（经HPLC及UPLC测定，冻干物中含丹酚酸B31.1mg/g、阿魏酸1.2mg/g）真空干燥器保存备用。临用前加生理盐水溶解。
2.2大鼠局灶性脑缺血模型的复制与评价
2.2.1模型制备[11]取SD大鼠，麻醉后仰位固定，钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），分别在CCA近心端、ICA和ECA根部近分叉处挂线备用，结扎CCA近心端以及ECA，在距CCA分叉部4mm处剪一“V”形切口，将栓线（取直径0.26mm尼龙鱼线50mm，一端酒精灯加热使之成光滑球面，将其垂直浸入在熔化的石蜡中并迅速提起，立即凝固的石蜡可牢固地黏附在鱼线表面，使其头端圆滑。在距球面20、30mm的位置做标记，浸泡0.1%的多聚赖氨酸溶液中，取出自然风干）插入到ICA，用眼科镊轻推栓线送入颅内，从血管分叉处开始算，插入深度在17mm时稍有阻力感时立即停止，结扎ICA以固定线栓，缝合皮肤。实验结束后将大鼠断头处死，迅速冰上取出脑组织。
2.2.2神经行为学评分采用5级4分评分法。0分：无神经功能缺损症状；1分：轻度神经功能缺损，提尾时不能完全伸展对侧前肢；2分：中度神经功能缺损，出现追尾征；3分：重度神经功能缺损，行走困难，向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识水平下降。
2.2.3TTC染色大鼠脑组织快速冷冻约20min，去除小脑、脑干。冠状切片均匀切成2mm厚度的脑组织5～6片，迅速置于1%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃恒温避光孵育15～30min，不时翻动脑片使其染色均匀，待完全显色后置4%多聚甲醛溶液中固定保存。
2.2.4舍弃标准无明显神经功能缺损表现或症状很轻，评分低于1分者；蛛网膜下腔出血、大脑中动脉起始部或其附近的大脑动脉环动脉有凝血块者；未存活到规定时间点死亡者；TTC染色未见梗死灶者。
2.3分组与给药
雄性SD大鼠随机分为对照组8只、假手术组8只、丹参-川芎干预组9只、模型组8只。假手术组麻醉后分离右颈总动脉结扎，不植入线栓，缝合伤口。模型组按照上述方法造模并进行神经行为学评分，按照入选和舍弃标准确定最终样本量。对照组、模型组、假手术组每天ig给予生理盐水，丹参-川芎干预组造模后，第2天按照体表面积折算给予相应体积的冻干物（总生药剂量为2.g/kg，丹参生药剂量1.g/kg，川芎生药剂量0.g/kg）生理盐水溶液，连续7d。末次给药1h后各组大鼠眼内眦采抗凝血1mL，4℃、r/min离心10min分离血浆，?80℃保存备用。
2.4丹参-川芎干预大鼠局灶性脑缺血的脂质组学研究
2.4.1液质联用条件（1）UPLC色谱条件：WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱（mm×2.1mm，1.8μm，含保护柱），柱温30℃，样品室温度4℃，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度条件：0～3min，90%～40%A；3～6min，40%～20%A；6～9min，20%～10%A；9～10min，90%～%B；10～13min，%B；13～14min，%～10%B；14～15min，10%B；体积流量0.3mL/min。（2）质谱条件：在全扫描获得一级谱图的同时进行数据相关采集模式（IDA）获得二级谱图。正离子模式：一级质谱m/z扫描范围为～，质量偏差为m/z0.，碰撞能（CE）为45eV。二级质谱采用highsensitivity模式，m/z扫描范围为50～，碰撞能为45eV。离子源雾化气（GS1）和辅助气（GS2）均为55Pa，气帘气（curtaingas，CG）为35Pa。温度为℃，喷雾电压为5V，去簇电压（DP）为80V。负离子模式：一级质谱m/z扫描范围为～，质量偏差为m/z0.，碰撞能为45eV，二级质谱m/z扫描范围为50～，碰撞能为45eV。GS1和GS2均为55Pa，CG为35Pa。温度为℃，喷雾电压为?4V，DP为?V。
2.4.2血浆样品前处理及测定血浆自然解冻后精密吸取0.15mL血浆于1.5mL离心管内（冰上操作），加入0.45mL4℃氯仿-色谱甲醇混合液（2∶1，含0.01%BHT）涡旋60s，室温下静置5min，加入μL超纯水混匀，1r/min离心10min，体系分为上层水相、中间层蛋白沉淀物、下层有机相。吸取下层液μL至5mL刻度离心管内，40℃氮气吹干，加μL乙腈涡旋1min，转移至1.5mL离心管内，?20℃冷冻后10r/min离心10min，2次，吸取上清液μL于装有内衬管的样品瓶中进样。正、负离子模式各进样4μL，获得总离子流图（TIC）。
取各组血浆样品等体积混合，前处理后作为质控样品。正式进样前连续进样6次使系统预适应和平衡。分析过程按照“对照组-模型组-假手术组-丹参-川芎干预组”的顺序交叉进样，每进8份样品进样1次质控样品，用于评价整个实验过程中系统稳定性。
2.4.3脂质组学数据处理采用PeakViewSoftware软件进行峰校准、背景扣除、面积归一化和数据简化处理，MarkerView软件生成正、负离子模式下的样品名-质荷比与保留时间数据对-离子强度的三维矩阵，经过滤噪处理后，导入SIMCA-P14.1软件（瑞典Umetrics公司），进行标准化前处理，采用Hotelling’sT2及DModX模型筛选异常样本。
采用Pareto标度法（Par）对对照组和模型组进行OPLS-DA处理，建立脂质组学模型，以R2（cum，表示所解释的模型差异）、Q2（cum，表示所预测的模型差异）作为脂质组学模型优劣的标准，自动拟合提取主成分。通过S型图（S-plot）、VIP图，识别局灶性脑缺血模型血浆脂质生物标志物。通过七重循环交叉验证（crossvalidation，CV）及次迭代置换检验以评价及确认模型的质量。
在进行准分子离子峰的归纳后，通过脂质组学数据分析，以变量重要性投影值（variableimportanceintheprojection，VIP）＞1、Jack-knife不确定区间不跨越零点、S-plot中∣Pcorr∣＞0.58为脂质生物标志物的入选标准。同时采用SPSS19软件（美国IBM公司）进行模型组与对照组、丹参-川芎干预组与模型组潜在脂质生物标志物Student’st-test等单维统计分析，以P＜0.05视为具有显著性，并计算变异倍数（FC）。
脂质标志物结构鉴定采用精确质量数匹配（误差＜1×10?5）和二级质谱解析的方式，检索互联网专业数据库，如HMDB（白癜风医院在哪里白癜风怎么回事
