摘要：目的从血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB）转运蛋白角度探讨冰片配伍黄芪甲苷（astragalosidesIV，ASTIV）和三七总皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）在脑缺血再灌注状态下促进药物成分入脑的作用。方法采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，ig给予冰片、ASTIV、PNS及其配伍药物，2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色法测定脑组织损伤，Westernblotting法检测脑组织外排蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药相关蛋白1（multidrugresistanceprotein-1，MRP-1）、MRP-2、MRP-4、MRP-5及摄取蛋白有机阳离子转运体3（organiccationtransporter3，OCT3）、有机阴离子转运多肽-2（organicaniontransportingpolypeptides-2，OATP-2）蛋白的表达，real-timePCR法检测脑组织多药耐药（multidrugresistance，mdr）基因mdr1a、mdr1b和mrp-1、mrp-2、mrp-4、mrp-5mRNA表达。结果TTC染色结果显示，脑缺血再灌注后，大鼠脑组织出现明显梗死灶。各药物能显著减少脑梗死体积，ASTIV＋PNS的效应强于ASTIV与PNS单用，冰片＋ASTIV＋PNS的效应强于各药物单用及ASTIV＋PNS。外排蛋白和基因检测显示，脑缺血再灌注后，大鼠脑组织P-gp、MRP-1、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表达均显著增多。与模型组比较，冰片能显著下调大鼠脑组织P-gp、MRP-2、MRP-4蛋白表达水平，PNS能显著下调MRP-4、MRP-5蛋白表达水平，ASTIV、ASTIV＋PNS与冰片＋ASTIV＋PNS能显著下调P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5蛋白表达水平，且冰片＋ASTIV＋PNS的效应显著强于各药物单用及ASTIV＋PNS，ASTIV＋PNS的效应显著强于ASTIV或PNS单用。基因表达结果与蛋白表达结果类似。摄取蛋白检测结果显示，与对照组比较，脑缺血再灌注后大鼠脑组织OCT-3蛋白表达在模型组及各给药组变化均不明显，而模型组OATP-2蛋白表达水平显著降低。PNS、ASTIV＋PNS及冰片＋ASTIV＋PNS能显著上调OATP-2蛋白表达水平，且ASTIV＋PNS的效应显著强于ASTIV、PNS单用，冰片＋ASTIV＋PNS的效应显著强于各药物单用及ASTIV＋PNS。结论脑缺血再灌注后，脑组织损伤，BBB的主要外排蛋白和基因表达均显著增强，而摄取蛋白OATP-2表达显著降低。冰片配伍ASTIV及PNS后，能增强抗缺血性脑损伤的作用，其作用可能与下调BBB中外排蛋白P-gp、MRP-2、MRP-4、MRP-5和相应基因表达，同时上调摄取蛋白OATP-2表达，促使脑组织中冰片、ASTIV及PNS有效成分的吸收与富集而发挥药理作用有关。
血脑屏障（bloodbrainbarrier，BBB）是中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）和血液的分界面，是维持脑内环境稳定的重要结构。生理状态下，一方面它允许血液中脑组织所需要的营养物质等通过；另一方面能阻挡有害物质的侵入，将有害物质和代谢产物排出，从而维持脑内环境的稳定。但也由于BBB的存在，药物无法或难以穿过BBB，在脑内浓度较低，不能充分发挥作用，成为CNS药物治疗的瓶颈。
BBB依赖特殊的血管内皮结构及转运蛋白来发挥屏障功能，这些转运蛋白负责识别和外排有害物质并吸收有益物质，根据转运方式，可分为外排蛋白和摄取蛋白。ATP结合盒（ATP-bindingcassettetransporter，ABC）转运体是BBB最重要的脂溶性分子外排转运体，可减少药物在脑组织中的蓄积[1]。目前研究较多的ABC转运体有P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药蛋白（multidrugresistanceprotein，MRP），在体内广泛分布在小肠、肝脏、肾脏、胎盘、脑及各类屏障（如血-脑屏障、血-脑脊液屏障、血-胎盘屏障）等部位[2]。摄取蛋白包括有机阴离子转运多肽（organicaniontransportingpolypep-tides，OATPs）、有机阴离子转运体（organicaniontransporters，OAT）、有机阳离子转运体（organiccationtransporter，OCT）和单羧酸转运体（monocarboxylatetransporter，MCT），BBB负责将CNS外的这些有机阴/阳离子，以载体介导的方式转入CNS[3]。
大量临床研究表明，脑梗死的基本病机是气虚血瘀，治疗应当益气活血。黄芪和三七是治疗心脑血管疾病的常用有效中药，黄芪具有补气之功效，三七具有活血化瘀作用，二者配伍具有益气活血的作用，临床常配伍使用。研究表明，黄芪总苷（astragaloside，AST）是黄芪中具有心脑血管效应的主要药效组分，主要含黄芪甲苷（astragalosidesIV，ASTIV）。三七总皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）是三七中具有心脑血管效应的主要药效组分，主要含人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1。前期研究发现ASTIV和PNS主要有效成分配伍可从多环节、多靶点发挥抗缺血性脑损伤的作用[4-8]，但ASTIV和PNS的主要成分由于其相对分子质量大、脂溶性低，透过BBB的量少，难以更好地在病变脑组织发挥药理作用[9-11]。
冰片是小分子脂溶性单萜类化合物，为龙脑香科植物龙脑香DryobalanopsaromaticaGaertn.F.树脂加工品或菊科植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.的鲜叶加工品，因其“独行则势弱，佐使则有功”（《本草衍义》），加之其“芳香走窜”“引药上行”，故常作为辅药或引经药使用以促进药物吸收及进入病变部位[12]。前期研究将冰片与ASTIV和PNS配伍，发现配伍冰片后可促进ASTIV、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1吸收入脑，增加脑组织药物成分的富集[13]，但机制尚不清楚。研究[14]表明，冰片促进药物吸收入脑的作用，可能与抑制P-gp的外排作用有关，因而，推测冰片与ASTIV、PNS配伍促进药物成分透过BBB也可能与BBB上的药物转运蛋白有关。本研究主要以相关转运蛋白为靶点探讨冰片促进ASTIV和PNS主要成分入脑的机制，为后期研究和临床应用奠定理论基础。
1材料
1.1药品与试剂
冰片（左旋龙脑，主要成分为1,7-三甲基-二环庚-2-醇，质量分数86%，批号）购自湖北俊辉有限公司；ASTIV（质量分数≥98%，批号MUST-）；PNS（质量分数≥98%，批号MUST-）、人参皂苷Rg1（质量分数≥98%，批号MUST-）、人参皂苷Rb1（质量分数≥98%，批号MUST-）和三七皂苷R1（质量分数≥98%，批号MUST-）对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司；依达拉奉注射液（3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5酮），购自南京先声东元制药有限公司，批号80-，规格10mg/支（5mL），药物用时以0.5%羧甲基纤维素钠配制成相应质量浓度混悬液。
P-gp兔单克隆抗体、MRP-1小鼠单克隆抗体、MRP-2兔多克隆抗体、MRP-4兔多克隆抗体、MRP-5兔多克隆抗体、OCT3兔多克隆抗体、OATP2兔多克隆抗体均为英国Abcam公司产品；β-actin兔多克隆抗体，美国ABclonal公司；HRP标记的山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗，美国Proteintech公司；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；Trizol、逆转录试剂盒，美国ThermoFisher公司；Sybergreenmix，近岸蛋白质科技有限公司；RIPA裂解液，康为世纪生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂，瑞士Roche集团；ECL化学发光液，北京鼎国昌盛生物科技有限公司；蛋白Marker，美国ThermoFisher公司；BCA试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumhloride，TTC），美国Sigma公司。
1.2动物
SPF级雄性SD大鼠，体质量～g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号15，饲养于湖南中医药大学动物实验中心，许可证号SKY（湘）-，实验前适应性喂养5～7d，给药前禁食12h，自由饮水。
1.3仪器
电泳仪、蛋白转膜槽、ChemiDoCXRS+化学发光凝胶成像仪、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪，美国Bio-Rad公司；A超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。
2方法
2.1大鼠大脑中动脉栓塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）/再灌注模型制备
采用改良Longa法[15]制作MCAO局灶性脑缺血模型大鼠。用10%水合氯醛（0.35g/kg）ip麻醉，于颈前正中位置备皮、消毒，切开3cm左右切口，钝性分离右侧颈总动脉（北京中科白殿疯医院在哪北京学生治疗白癜风多少钱
