临床研究方法及文章发表方法培训
临床科研方法与论文写作能力提升大师（网络）研讨会（10月4-16日） 年10月4-16日卒中是终身残疾及死亡的主要原因之一，超过80%的卒中由缺血事件引起。目前组织型纤溶酶原激活物是唯一被美国FDA批准的治疗用药，但该疗法时间窗短，且增加出血风险。因此仍需开发其他有效药物治疗以改善患者预后。血脑屏障由内皮细胞，基底膜，周细胞，星形胶质细胞终足构成，具有选择透过性，其中内皮细胞间紧密连接是大脑的守门人，可防止血源性有害物质进入脑部。而卒中常伴随血脑屏障的破坏进而导致患者预后更差。血脑屏障受损后，其渗透性增加，毒素，免疫细胞和炎症因子可穿过该结构进入大脑，增加脑水肿，脑出血进而导致死亡率增加。基质金属蛋白酶2型及9型可溶解内皮紧密连接破坏基底膜蛋白，在损伤血脑屏障中起重要作用。但是卒中后血脑屏障损伤的具体危险因素及主要诱因尚不清楚。脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（FABP4/A-FABP）为脂肪细胞、巨噬细胞和内皮细胞分泌的主要脂肪因子，既往我们认为其主要促进细胞与循环血之间脂肪酸的转运，但近期研究发现其具有促炎作用，可诱导代谢功能失调。许多临床研究也提示，其参与缺血性卒中的发生发展。循环血中A-FABP升高常见于二型糖尿病、高血压和血脂异常的患者中，而这些疾病也为卒中的常见危险因素。而最新研究也发现，卒中患者血清A-FABP水平升高且与早期死亡和不良预后相关。因此A-FABP可能是卒中的独立预测因子。但其在卒中发生发展中的病理作用及分子机制尚不清楚。
对此，来自香港大学医学院的研究团队构建A-FABP敲除小鼠模型以探索A-FABO对卒中及对血脑屏障损伤的影响和相关机制，并在卒中患者中对A-FABP的影响进行临床评估。该研究结果发表于心血管领域顶级期刊《EuropeanHeartJournal》上，题目为“Adipocytefattyacid-bindingproteinexacerbatescerebralischemiainjurybydisruptingtheblood–brainbarrier”。
结果解读：
急性缺血性卒中后小鼠血浆及脑部A-FABP水平上调
首先，研究者对C57BL/6N小鼠中进行大脑中动脉阻塞手术（MCAO）（缺血1小时-再灌注），检测到血清A-FABP水平在术后2h开始升高，于48小时达峰，72小时后逐渐降低至基线水平，脑组织A-FABP蛋白和RNA水平同样于2小时后开始升高。为确定循环中A-FABP水平上升是主要由哪种细胞分泌该蛋白增多，研究者运用流式分选技术分选出MCAO术后小鼠外周血免疫细胞并检测到单核/巨噬细胞和小胶质细胞中A-FABP在mRNA水平上显著升高，说明缺血诱导的脑缺氧状态下，A-FABP于单核细胞和小胶质细胞中表达上调，从而导致循环血中及脑组织内A-FABP水平上调。
Figure1：急性卒中后小鼠循环及脑组织中A-FABP浓度升高
A-FABP敲除减轻缺血性脑损伤
为探索A-FABP在缺血性脑损伤中的作用，研究者构建了A-FABP敲除小鼠模型并进行MCAO手术，分别检测术后1天，7天梗死面积，脑水肿程度评估神经功能，及神经元凋亡程度，发现与野生型相比，A-FABP敲除小鼠梗死面积更小，水肿程度更低，神经功能障碍程度更低，神经元凋亡减少，死亡率降低，同时，梗死区免疫细胞浸润及炎症细胞因子水平更低。
Figure2:A-FABP敲除保护卒中后缺血损伤
单核细胞及小胶质细胞来源的A-FABP加重缺血性卒中损伤
接下来，研究者对野生型小鼠及A-FABP小鼠进行骨髓移植后构建缺血性卒中模型，发现，移植了A-FABP敲除小鼠骨髓的野生型小鼠循环及脑组织A-FABP水平降低，相对于接受野生型骨髓的野生型小鼠，其卒中预后更好。而A-FABP敲除小鼠接受野生型小鼠骨髓后A-FABP水平更高，相对于接受A-FABP骨髓的A-FABP敲除小鼠，其卒中预后更差。但是在接受不同种来源骨髓的野生型及A-FABP敲除小鼠中，其卒中结局相似。以上结果表明，骨髓来源的单核/巨噬细胞来源的A-FABP在诱导卒中不良结局中起重要作用，而小胶质细胞对卒中的影响与之相似。
药物抑制A-FABP可减轻脑缺血性损伤
接下来，研究者向野生型小鼠A-FABP选择性抑制剂BMS，发现MCAO术后1天及7天，小鼠脑部梗死灶面积明显减小，脑水肿，神经元损伤及神经元凋亡程度减低。
A-FABP促进缺血后血脑屏障损伤
由于血脑屏障的损伤为缺血性卒中后神经元损伤的重要前提事件，研究者检测了A-FABP敲除小鼠血脑屏障的通透性，发现与野生型小鼠相比，MCAO术后，敲除鼠脑组织伊文思蓝渗透及免疫球蛋白外渗减少，而血脑屏障内皮紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达相对较高。MCAO术后，野生型小鼠接受BMS治疗后血脑屏障损伤减轻。以上表明，基因敲除或药物抑制A-FABO进而减轻缺血后血脑屏障损伤。
Figure3：A-FABP敲除抑制血脑屏障损伤
A-FABP敲除抑制小鼠MCAO术后MMP-9表达上调
由于MMP家族在血脑屏障的损伤中起重要作用，因此研究者分别检测了MMP2,MMP3,MMP12及MMP9在MCAO术后的mRNA水平年后，发现MCAO诱导野生型小鼠MMP9表达上升约9倍。相比之下，A-FABP敲除小鼠MMP9的表达量及活性均受到抑制。BMS依然可以抑制野生型小鼠MCAO术后，MMP9的表达量及活性。以上结果表明，缺血性卒中诱导的A-FABP上调与MMP9的表达及活性相关。
因此，研究者在缺血性脑损伤患者中继续探究二者的相关关系，发现卒中24小时后，急性卒中患者血清MMP-9及A-FABP水平相对于对照组显著升高，二者血清浓度液显著相关，而A-FABP水平也与梗死面积正相关。
Figure4：A-FABP调控MMP9水平
A-FABP通过MMP-9促进脑缺血性损伤
为证明A-FABP是否通过调控MMP-9加重卒中后脑损伤，研究者在A-FABP敲除小鼠中运用腺病毒过表达A-FABP，同时在MCAO术后使用MMP-9抑制剂SB-3CT处理。结果表明，进一步表达A-FABP的A-FABP敲除小鼠中，MCAO术后MMP-9活性显著升高，梗死面积增大，脑水肿及神经元损伤加重，死亡率升高，血脑屏障通透性增加，而SB-3CT处理后MMP-9活性受到抑制，以上表现也显著缓解。这说明A-FABP通过诱导MMP-9的活性和表达促进缺血性卒中脑损伤。
Figure5：A-FABP通过MMP-9促进脑缺血性损伤
A-FABP通过JNK/c-Jun通路促进MMP-9表达
最后，研究者探索了A-FABP对MMP-9的分子调控机制。由于A-FABP与JNK，AP-1共同构成调控反馈环，促进LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，而AP-1为MMP-9反式激活的调控因子。因此，A-FABP可能通过激活JNK/c-Jun通路激活MMP-9表达。MCAO诱导的脑组织A-FABP及MMP-9表达与JNK和c-Jun的磷酸化相关，而A-FABP敲除小鼠中，这些磷酸化水平均降低。野生型小鼠的骨髓细胞在缺氧无糖状态下，A-FABP及MMP-9表达亦显著上调，同样伴随着JNK/c-Jun信号通路的激活，相比之下在，A-FABP敲除小鼠骨髓中，以上现象均减弱。为探索是否A-FABP通过JNK/c-Jun通路调控MMP-9表达，研究者进一步过表达A-FABP敲除鼠骨髓细胞中A-FABP，并用JNK通路抑制剂SP处理后进行缺氧无糖培养。结果表明，JNK通路抑制现在降低A-FABP诱导的MMP-9表达。既往研究发现小鼠AP-1中有两种MMP-9的顺式作用元件。为评估是否A-FABP/JNK/c-Jun通路是否直接调控MMP-9表达，研究者运用荧光素酶报告基因实验，构建了含有MMP-9启动子片段的报告基因质粒，转染至有或无A-FABP过表达的HEK细胞中，在A-FABP过表达的细胞中，荧光素酶活性显著升高，且可被MMP-9抑制剂抑制。而AP-1位点的突变则抑制MMP-9启动子激活，导致A-FABP过表达后荧光信号减弱，表明AP-1的两个位点对A-FABP调控的MMP-9表达至关重要。以上结果表明A-FABP促进JNK/c-Jun活性从而拘谨MMP-9启动子AP-1位点与p-c-Jun结合，诱导缺氧状态下MMP-9的反式激活。
Figure6：A-FABP通过JNK/c-Jun通路促进MMP-9表达
结论：A-FABP是缺血性卒中脑损伤的重要调控因子，可促进MMP-9诱导的血脑屏障损伤。抑制A-FABP可能为改善缺血性卒中预后的潜在有效措施。
文献来源：doi:10./eurheartj/ehaa
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