研究背景
血管细胞外基质成分纤维连接蛋白(FN)作为整合素受体家族的配体，在细胞粘附、迁移、生长和分化中发挥重要作用，能调节外周组织和肿瘤中的血管生成。FN与中风有关，可能参与中风后的组织自我修复。FN中的协同肽基序PHSRN(Pro-His-Ser-Arg-Asn)可通过与α5亚单位相互作用促进整合素α5β1与FN的结合，具有促进上皮伤口愈合、癌细胞和内皮细胞迁移和血管生成的潜力，还能促进神经元粘附，增强神经元生长和突触可塑性。这些发现表明，PHSRN具有促血管生成和神经保护作用，但其在缺血性卒中中的作用尚未被探讨。
研究结果
01.
PHSRN诱导缺血区域整合素α5上调缩小MCAO大鼠脑梗死体积并促进行为恢复
TTC染色显示腹腔注射给予MCAO大鼠PHSRN保持了脑细胞的活力，梗死灶明显减少，表明PHSRN在脑内具有神经保护作用。此外，给予PHSRN大鼠神经行为学评分和转棒测试均得以改善。表明PHSRN可维持MCAO大鼠神经元活性，促进功能恢复。通过免疫荧光示踪PHSRN在体内的循环，MCAO大鼠腹腔注射PHSRN特异性靶向损伤侧脑实质的内皮细胞和细胞外基质的细胞膜，CD34免疫荧光染色与此密切相关，表明PHSRN的血管生成作用可能与内皮祖细胞的招募相关。此外，WB实验证明，PHSRN治疗后α5整合素水平上调，表明PHSRN可能与其受体相互作用并激活下游的细胞内信号转导。
图1.PHSRN治疗减少了MCAO大鼠的脑梗死体积，并减轻了行为学测试结果。(1)TTC染色(2)TTC染色定量(C)mNSS评分(D)转棒测试
图2.PHSRN靶向MCAO大鼠的脑缺血区域(A)VW因子和PHSRN-His-Tag免疫荧光染色(2)CD34-6和PHSRN-His-Tag免疫荧光染色(C)Westernblotting检测PHSRN治疗MCAO大鼠后的整合素α5
02.
PHSRN治疗通过FAK-ERK通路和整合素α5β1诱导MCAO大鼠血管生成
免疫荧光染色显示PHSRN治疗的大鼠半影区增殖的内皮细胞更多，同时表达Ki67和VW因子，BrdU和VW因子双阳性免疫反应更多，表明血管恢复，PHSRN促进了MCAO后的血管生成。WB实验显示，缺血损伤下调了磷酸化的FAK、RAS、c-Raf和ERK的水平，而PHSRN治疗恢复了这些水平，并刺激了VEGF的合成。提示PHSRN通过激活FAK-ERK通路发挥促血管生成作用。ELISA数据显示，PHSRN处理原代内皮细胞后，VEGF水平呈剂量依赖性增加，并且通过整合素α5β1受体促进血管内皮生长因子的分泌。免疫荧光染色显示PHSRN能显著促进内皮小管形成，内皮细胞的活力和增殖都增加。然而，抗整合素α5抗体阻断后，内皮小管的形成和内皮细胞的增殖都受到抑制，提示PHSRN的促血管生成作用是通过整合素α5介导的。
图3.PHSRN治疗促进了MCAO大鼠的血管生成。(A)VW因子和Ki67免疫荧光染色，箭头表示VWF和Ki67双阳性细胞(B)VW因子和BrdU免疫荧光染色(C和D)定量测定内皮细胞覆盖面积比和新合成的内皮细胞比
图4.给予PHSRN激活了MCAO大鼠整合素α5β1的下游信号。
图5.PHSRN体外诱导VEGF分泌和血管生成。(A)PHSRN处理的内皮细胞培养液，或对照组的培养上清液的VEGFELISA检测(B)AlarmaBlue用或不用PHSRN治疗的内皮细胞活性测定(C)内皮细胞的VW因子免疫细胞化学染色(D-H)BrdU标记分析培养的内皮小管形成情况、结节数、管长、管复盖率、新增殖内皮细胞的比例
03.
PHSRN治疗通过细胞内VEGF信号通路发挥神经保护作用
对半影区进行双皮质酮(DCX)和Ki67的免疫荧光染色，PHSRN治疗后的神经干细胞数量明显增加，共表达DCX和BrdU的细胞数量比对照组多，表明PHSRN可能促进中风后的神经发生。NeuN免疫荧光染色数据显示，PHSRN治疗促进了MCAO后皮层和海马半影区神经元的存活和神经元数量的恢复。WB实验显示PHSRN治疗可显著降低缺血大鼠脑内caspase-3的表达。这些数据表明，PHSRN通过增加MCAO大鼠VEGF的生成发挥神经保护作用并减少细胞凋亡。
图6.PHSRN治疗促进了MCAO大鼠的神经发生。(A)双皮质素(DCX)和Ki67免疫荧光染色，箭头表示DCX和Ki67双阳性细胞(B)双皮质素(DCX)和BrdU免疫荧光染色，箭头表示DCX和BrdU双阳性细胞(C)MCAO大鼠测定DCX阳性细胞数和新生神经干细胞比率
图7.PHSRN治疗促进了MCAO大鼠神经元数量的恢复。(A)根据NeuN免疫荧光染色数据进行神经元计数(B)MCAO后caspase-3的免疫印迹
04.
PHSRN诱导内皮细胞分泌VEGF，激活神经元细胞内信号转导维持神经元存活和轴突延伸
通过对原代培养的大鼠皮层神经元进行氧糖剥夺实验（阻断神经元中的VEGF受体）。AlarmaBlue数据显示，经PHSRN处理显著提高了神经元的存活率。通过MAP2的免疫荧光染色表明，PHSRN能在OGD损伤后维持轴突生长。这些结果表明，PHSRN介导内皮细胞释放的VEGF是神经保护中的关键介质。PHSRN激活了PI3K的表达并刺激了AKT的磷酸化，还能增加MAP2、突触素和PSD95的表达，增强FAK的磷酸化。当神经元VEGF受体被阻断时，PHSRN不再发挥作用。因此，证实了内皮细胞分泌的VEGF对于维持OGD后神经元存活和轴突形态是必不可少的，揭示了PHSRN诱导MCAO大鼠运动功能恢复的可能机制。
图8.PHSRN保护体外缺氧缺糖(OGD)后神经元形态的复杂性和存活率。(A)MAP2的免疫细胞化学染色的图像(B)AlarmaBlue用于评估OGD和条件培养液处理后神经元活性(C-E)原代培养神经元在OGD和条件培养基处理后存活神经元的数目、轴突长度和分支点的生长分析
图9.PHSRN条件培养液激活OGD神经元中VEGF下游信号和轴突成熟。(A)PI3K、磷酸化AKT、磷酸化FAK、总FAK、MAP2、PSD95和SYP在对照组或OGD神经元条件培养液中的免疫印迹（B)免疫印迹定量
结论
PHSRN可缩小MCAO大鼠梗死灶的体积，改善神经功能，减轻运动功能损害。腹腔注射后，PHSRN以受损脑区为靶点，分布于内皮细胞。PHSRN通过激活整合素α5β1及其下游的细胞内信号，如粘着斑激酶、RAS、CRAF和细胞外信号调节激酶，显著促进血管生成和血管内皮生长因子的分泌。PHSRN治疗还刺激了MCAO大鼠的神经发生，并通过诱导VEGF分泌来维持神经元存活和神经元的形态复杂性。总而言之，这些结果研究整合素α5β1在脑缺血后的作用，支持PHSRN肽用于卒中治疗的可行性。
撰文：孙红
排版：孙红
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