人羊膜上皮细胞的潜能
多发性硬化的免疫调节和神经再生治疗
多发性硬化(MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的慢性自身免疫性疾病。虽然这种疾病目前有许多治疗方法,但都是以不同的作用靶向免疫系统为目标,并且常常伴随着严重的副作用。另外,尽管这些药物可以预防复发,并使长期残疾最小化,但它们不能治愈,不能帮助受损神经组织再生,也不能保护中枢神经系统免受与进行性MS相关的神经变性。因此,迫切需要开发对复发缓解和进展性MS患者有效的新疗法,做到不仅可以预防中枢神经系统损伤,还可以协助修复。一种潜在的治疗方法是干细胞移植,正在进行的该临床模型有效性的临床研究证明,许多不同的干细胞类型在MS小鼠模型中是有效的。一种新型的干细胞源是人羊膜上皮细胞(hAECs)。这些细胞已被证明能够迁移到中枢神经系统内的炎症部位,移植并分化成神经系,抑制炎症。鉴于其免疫抑制和神经再生的潜力,hAECs是治疗MS和其他影响中枢神经系统神经退行性疾病的强有力的候选者。
多发性硬化多发性硬化症(MS)是中枢神经系统(CNS)的一种炎症性疾病,影响全世界多万人。这种疾病最常见于20至40岁的年轻人,对女性的影响比男性更常见。MS的症状是多种多样的,最常见的包括感觉丧失、视力模糊、膀胱功能障碍、疲劳、记忆丧失和麻痹。该病的主要病理特征包括:中枢神经系统白质内血脑屏障(BBB)的破坏和分界斑块的形成,这些斑块由浸润的免疫细胞、局部髓鞘破坏、少突胶质细胞丢失、轴突变性和反应性胶质增生组成。尽管有这些共同特征,MS在临床上和病理上仍被高度地认为是一种异质性疾病,在临床表现和临床病程方面存在很大程度的变异。MS可分为四类,包括复发-缓解(RR)、继发性进展(SP)、原发性进展(PP)和进展性复发(PR)。有人认为MS的病程始于两个阶段,即初始浸润期和退行期。在疾病的最初炎症阶段,主要表现为RR-MS,急性炎症性脱髓鞘斑块在含有淋巴细胞、前炎症细胞因子、趋化因子和活化的巨噬细胞/小胶质细胞的白质内形成。RR-MS是大约70%的患者中最常见的MS形式,其特点是突然发作导致神经功能障碍,随后是缓解期,有时或许可以完全康复。约50%的RR-MS患者在用RR-MS首次呈现后继续发展为SP-MS。SP-MS期的特征在于残疾程度的稳步增加,很少或没有恢复期,炎症和脱髓鞘过程的减少和神经变性的增加与RR-MS向SP-MS的转变有关。人们相信,一旦补偿机制被打破,就会发生向疾病的神经退行性阶段的过渡,并且神经功能障碍会变得具有永久性。PP-MS影响大约10%的MS患者,其特点是发病后神经功能持续恶化,没有明显的缓解期。最后,PR-MS在将近5%的病例中发生,从发病开始就显示疾病进展,包括明显的急性复发期,有或没有的恢复期。
遗传和环境危险因素自身免疫疾病的发展被认为涉及几个因素,包括自身反应性T细胞的存在,这些细胞在胸腺T细胞发育过程中没有被清除掉,以及疾病易感基因的遗传,这些基因与环境相互作用触发促进这些自身反应性T细胞的活化。虽然MS是一种病因不明的多因素疾病,但现在显而易见的是,遗传背景和暴露于某些环境因素增加了发生MS的机会。许多研究提供的强有力的证据表明,在多案例MS家族中的易感性变异,有遗传组成的MS,具有较高的易感性和聚集性。众所周知,在高加索人群中,MS与人白细胞抗原(HLA)-DRB1*有很强的遗传关联。在其他地理区域,也已发现了类似的遗传关联。撒丁岛人群中不同的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类等位基因,如HLA-DRB1*、HLA-DRB1*和HLA-DRB1*。虽然MHC被认为是主要的易感位点,但大规模全基因组关联研究已经发现许多新基因与MS易感性有适度的关联。有趣的是,大多数被鉴定的基因涉及免疫功能,包括细胞因子途径(白细胞介素(IL)7RA、IL2RA、CXCR5、IL12A、肿瘤坏死因子受体超家族,共刺激因子1A和干扰素调节因子8)(CD58、CD80和CD86)和信号转导(STAT3,CBLB和MALT1)因素。
尽管有确凿的证据支持遗传因素,但流行病学研究表明,其他因素也与MS的易感性有关。对单卵双胞胎的研究不能确定解释疾病不协调的遗传、表观遗传或转录组差异,这意味着环境因素也是卷入其中的。在温带气候区域内,MS的发病率和流行率随着纬度的增加而增加。造成这种差异的原因尚不清楚,但据推测,维生素D水平的缺乏可能是环境因素之一。最近的一项研究还表明,HLA-DRB1*15等位基因的转录受维生素D/维生素D受体复合物的调节,为第一次提供连接与MS发病相关的主要遗传和环境因素之间的相互作用的模型。另一个与MS有关的环境触发因子是爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染。EBV可能触发MS的机制被认为是分子模拟,根据该模型,自反应性T细胞通过与能够模拟宿主抗原的病毒衍生产物交叉反应而被激活,这导致自肽靶向。MS患者在循环和脑脊液(CSF)中髓鞘反应性T细胞活化频率增加,这与假设启动事件与遗传易感宿主感染有关。这可能导致自身免疫介导的脱髓鞘和轴突破坏。
MS中免疫系统的参与
显然,免疫系统是一个主要的引发剂,目前是MS的主要治疗靶点。免疫系统由适应性和先天性两个手臂组成,两者均由细胞介导和体液成分组成。T细胞是细胞介导的免疫应答的一部分,在T细胞发育过程中,称为中央耐受的过程确保了通过凋亡消除自身反应性T细胞。中心耐受误差导致自体反应性T细胞逃逸到外周。由于中枢耐受性下降,确实逃逸到外周淋巴器官的自身反应性T细胞仍受到外周调节机制的严格调控,这可能导致这些自身反应性T细胞变得无能或缺失。此外,B细胞作为体液适应性免疫应答的一部分,在中枢神经系统炎症和脱髓鞘中正日益被看作多能参与者。B细胞能促进幼稚T细胞分化为Th1和Th17致病性T细胞,这种作用可通过B细胞耗竭而逆转。此外,对rMOG诱导的B细胞缺陷小鼠EAE的研究表明,用MOG启动的B细胞或MOG启动的血清重建EAE的敏感性是必要的。
T细胞活化及其进入中枢神经系统
外周髓鞘反应性T细胞被认为在MS发病中起关键作用,但其初始激活的原因尚不清楚。在炎症反应过程中,幼稚的T细胞由专业的抗原呈递细胞(APC)如树突状细胞(DC)和巨噬细胞启动,这些细胞吞噬和处理抗原,形成能被其他免疫细胞识别的片段。这些细胞未能维持耐受性已显示导致自身免疫疾病,包括MS。原发性T细胞活化需要肽-MHC复合物与T细胞受体(TCR)的相互作用,以及与其他共同刺激信号。一旦激活,T细胞(CD4+T细胞)就可以破坏BBB并跨越到中枢神经系统。在中枢神经系统内,CD4+T细胞通过TCR与由局部APCs呈递的同源中枢神经系统抗原的结合而被重新激活,导致T细胞增殖和分泌促炎性细胞因子,其他效应细胞,如单核细胞和巨噬细胞。巨噬细胞分泌细胞因子、趋化因子和细胞毒性分子,如谷氨酸和一氧化氮,促进髓鞘的破坏和轴突损伤。而CD4+T细胞也被认为是脑脊髓炎(EAE)的主要致病成分,其发病机制也依赖于许多其他细胞类型。例如,最近显示髓样DC通过优先促进幼稚CD4+T细胞向Th17细胞的分化来驱动EAE中的复发。星形胶质细胞和小胶质细胞在健康的CNS组织中表达可忽略不计的MHC分子水平,然而,在FIL麻醉期间,这些细胞上调MHCII和共刺激分子并产生细胞因子如IL-12和IL-23,从而进一步促进T细胞应答。
图21.1CD4+T细胞分化、细胞因子产生及其作用幼稚的CD4+T细胞离开胸腺,并且通过与抗原呈递细胞的相互作用,它们根据存在的细胞因子环境分化为不同的CD4+T辅助细胞谱系。这些谱系包括Th1、Th2、Th17和Treg,它们是天然来源于胸腺或在外围诱导的。每一个谱系都在不同转录因子的控制下,被它们产生的特定细胞因子所破坏。已知Th1和Th17细胞是启动和增强EAE和MS的促炎性T细胞,而Th2和Treg细胞是抗炎性T细胞,有助于抑制和逆转疾病严重程度。
CD4+T细胞分化与细胞因子分泌
多年来,人们一直认为CD4+幼稚T细胞可以通过两种途径被驱动,产生促炎性T辅助细胞1(Th1)或抗炎性T辅助细胞2(Th2)。在IL-12的控制下,Th1细胞从幼稚的CD4+T细胞分化,IL-12主要由活化的DC表达,而IL-4促进幼稚的CD4+T细胞分化为Th2细胞(图21.1)。每一个谱系在不同转录因子的控制下,被它们产生的特定细胞因子所破坏。Th1细胞主要分泌IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α,而Th2细胞分泌IL-4、IL-6和IL-13。EAE和MS发病的主要效应T细胞系被认为是Th1细胞,因为两种疾病都与中枢神经系统中IFN-γ和IL-12表达的增加有关。因此,IFN-γ成为EAE研究中免疫调节和保护的主要靶标之一。然而,很快发现IFN-γ和IL-12不是参与EAE发病的唯一细胞因子,因为缺乏IFN-γ和IL-12的小鼠比野生型产仔小鼠表现出更严重的疾病进展。
新的CD4+T细胞系包括IL-23和IL-17,在EAE的发病机制中起着重要作用。这个新的亚群,称为T辅助细胞17(Th17),分泌IL-17、IL-21和IL-22,它们的分化受转化生长因子β(TGF-β)、IL-6和IL-23(图21.1)的控制。Th17细胞能在EAE中增强自身免疫应答,并在过继转移到小鼠体内诱导EAE。根据这些结果,与野生型产仔小鼠相比,IL-17抗性小鼠发生较轻的EAE,并且针对IL-17的中和抗体改善EAE。IL-17也与MS有关,在慢性MS病变中检测到的IL-17转录本数量与急性病变或患者的对照组织相比有所增加。有趣的是,与Th17细胞相似,TGF-β也是T调节的发展所必需的。(Treg)细胞(图21.1)提示某些发育Th17/Treg谱系之间的可塑性。TGF-β从FoxP3中诱导转录因子对于Treg的发育是至关重要的,但是IL-6的存在可以抑制FoxP3的上调和向Th17表型的T细胞分化。因此,有人提出,IL-6的产生可能通过调节Th17/Treg平衡在控制EAE炎症的程度方面很重要。Treg通常被归类为CD4+CD25+T细胞,但是近年来FoxP3对于自然发生的Treg细胞的发育和功能是必需的。据信,在胸腺的T细胞发育过程中,自然发生的FoxP3阳性的Tregs被输送到外周,在那里它们占CD4+T细胞的5%-10%。为了增加这些外周耐受机制的复杂性,自然发生的FoxP3+Tregs不是唯一存在的调节性T细胞。许多其他的调节性T细胞已经被描述包括TGF-β产生T辅助细胞3(Th3)、IL-10产生1型T调节(Tr1)细胞、CD8+CD28_T细胞、γδT细胞和NKT细胞。
MS神经退行性变现已认识到,除了脱髓鞘外,MS的进展还导致神经元的相当大的损伤,从而导致脑萎缩和累积性残疾。此外,轴突退行性变与晚期MS的永久性残疾和脑萎缩直接相关。然而,有文献证明,在RR-MS中,早期MS的脱髓鞘不是永久性的,并且发生少突胶质细胞再髓鞘化。这表明大脑确实具有内源性修复机制,然而,随着时间的推移,这些机制要么失效,要么不再足以修复正在进行的损伤。
导致中枢神经系统自身修复失败的因素有很多,包括星形胶质瘢痕形成的物理屏障和生长抑制因子的释放,它们抑制祖细胞的迁移,不仅阻止髓鞘形成,而且阻止轴突再生。这些抑制因子可以由许多细胞产生,包括少突胶质细胞前体细胞(OPCs)、小胶质细胞和脑膜成纤维细胞。此外,在受损区域发现髓鞘碎片也有助于抑制轴突再生。迄今为止,已有5种髓鞘蛋白具有抑制活性,其中包括NogoA、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、信号素4D和肾上腺素B3。这些蛋白的信号传导导致生长锥塌陷,这通常驱动生长轴突向其靶点的延伸。
众所周知,大脑具有有限的可塑性,然而,内源性OPCs已经在成人大脑中被识别出来。此外,在慢性MS病变中已经鉴定出OPCs,它们似乎与营养不良的轴突相互作用,但无法重新髓鞘化这些受损的轴突。内源性少突胶质细胞修复失败的机制尚不完全清楚,但据信是由于髓鞘抑制蛋白的存在以及星形胶质瘢痕的存在、OPCs的募集不足以及它们分化能力的障碍使其进入髓鞘化少突胶质细胞。多能祖细胞,包括OPCs和神经祖细胞(NPCs),驻留在中枢神经系统的特定区域,包括脑室下区OPCs的迁移受多种趋化因子和化学感受器的调节。来自生长因子如血小板衍生生长因子-A(PDGF-A)的线索招募OPCs到中枢神经系统的损伤区域,其中需要进一步刺激以促进增殖、分化和髓鞘化。MS中BBB的破坏导致脑室下层(SVZ)中的祖细胞暴露于指导其迁移的额外刺激分子,如神经生长因子(NGF)。NGF在神经元分化和存活中起重要作用,也刺激少突胶质细胞分化。因此,能够增强这种内源性修复过程的治疗模式对于改善MS患者的临床结果将是重要的。
当前MS疗法目前还没有治愈这种疾病的方法,因此正在大力开发治疗MS的新疗法,并了解这种疗法发挥作用的机制。然而,临床使用的大多数药物都以免疫调节或免疫抑制的方式,主要目的是使免疫系统失效。这可以通过多种方式实现,包括靶向与疾病病理学相关的免疫细胞(即活化的T细胞)的整个群体、阻断外周淋巴细胞向中枢神经系统的迁移或通过删除和替换现有的免疫系统“复位”免疫系统。目前在澳大利亚可用于RR-MS的治疗包括干扰素-β(IFN-β)制剂(Avonex、Betaferon和Rebif)、醋酸格拉替拉姆(Copaxone),纳他利单抗(Tysabri)、芬戈里莫德(Gilenya)和Teriflunomide(Aubagio)与富马酸二甲酯(Tecfidera)目前正在接受治疗品管理局的审查。虽然IFN-β制剂和醋酸格拉替拉姆治疗已被证明是安全的长期应用并导致复发次数减少,但近70%的RR-MS患者没有反应,并且在进展型MS患者中显示出很小的效果。Natalizumab是一种更有效的治疗,但这是渐进性多灶性白质脑病(PML)的风险。其他能够特异性阻断与MS发病机制相关的分子的人源化单克隆抗体正在完成临床试验:这些抗体包括达克利珠单抗(Zenapax)、利妥昔单抗(Ritu.ab(Rituxan))和阿仑图珠单抗(Campath)。Fingoloimod和TeIFLUnimIDE特异性靶向淋巴细胞,已知在疾病发病机制中起作用,并显示出中等疗效。然而,这些新疗法的一个根本问题是,虽然它们耗尽或功能性抑制致病性免疫细胞,但它们对正常免疫应答也有同样的作用。这使得病人免疫受损,正如已经证实的散发性疱疹和水痘死亡。因此,显然需要改善治疗,旨在提供更具体的“靶向”治疗,以及纳入神经保护策略,以防止疾病进展为慢性残疾。本综述的其余部分将探讨新的治疗策略的潜力,该策略可能有助于克服我们当前治疗MS方法面临的一些陷阱,干细胞治疗不仅具有提供免疫抑制的承诺,但也有潜在的神经保护和神经再生。
干细胞治疗MS的潜力干细胞具有多潜能性和自我更新能力,这是它们在特定组织龛内的发育、维持和修复中的重要作用。鉴于干细胞还具有高度免疫抑制作用,原则上,除了潜在地促进和/或加强自发性再髓鞘化外,干细胞是针对MS炎症过程的理想靶点。人和小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的移植以及神经前体细胞(NPC)的移植,已被证明改善EAE的临床症状以及减少中枢神经系统病理。还表明,当MSCs被注射到EAE小鼠的脑室内时,它们将转运到CNS干扰素区域。一项大型国际多中心临床试验目前正在进行中,评估MSC治疗活性RR-MS的安全性和有效性。然而,骨髓间充质干细胞的治疗应用存在局限性。这些包括通过骨髓活检获取这些细胞的侵入性程序的要求,以及可以从成人组织中分离的成人干细胞数量较少,需要广泛的培养扩增。这限制了它们在自体移植中的应用。一种新型的干细胞在干细胞研究界中作为一种潜在的替代物而引起人们的兴趣,即人羊膜上皮细胞(hAECs)。这些细胞的优点在于它们很容易从废弃的足月胎盘大量获得,并且据报道它们具有与胚胎干细胞(ESC)和骨髓间充质干细胞(MSCs)的特性。鉴于仅在澳大利亚每年就有大约30万婴儿出生,羊膜就提供了丰富的再生细胞材料的潜在来源,并且不具有与从废弃胚胎中获取ESC相关的伦理约束。与ESCs相似,hAECs具有多能性,并且能够在培养中扩增,尽管从单个羊膜获得的大量细胞可能排除了在临床上的扩展。重要的是,与ESCs相比,hAECs不在体内形成畸胎瘤。hAECs显示出较强的免疫调节作用。免疫抑制特性,从而为潜在的临床应用在自身免疫性疾病治疗中提供显著的实用优势。
虽然干细胞治疗已经在许多疾病模型中显示出希望,但是最佳给药的问题仍然没有解决,并且很可能是具有疾病特异性的。然而,适当的剂量和给药途径对于用这种疗法成功治疗疾病是非常重要的。关于神经退行性疾病的干细胞治疗,目前许多临床前研究已经探索了不同的给药途径,包括局部输送到中枢神经系统、静脉和腹腔注射。局部给药的理由是允许干细胞移植到受损组织中,并可能分化为神经元细胞。不幸的是,虽然一些动物研究已经证实了干细胞移植和潜在的神经分化,但是现在人们普遍认为干细胞移植到中枢神经系统组织很差,尽管它们具有临床效果。此外,临床改善已发现可比全身或局部干细胞递送,这表明干细胞最有可能通过释放可溶性因子而发挥作用。因此,目前的共识是,干细胞治疗最有可能通过调节免疫系统和潜在地增加神经再生而发挥作用,不是通过分化,而是通过释放支持宿主神经再生的神经营养因子。
hAECs的免疫调节能力在许多体外检测和体内疾病模型中已经研究了hAECs的免疫调节潜能。据信,hAECs对包括T细胞、B细胞和巨噬细胞在内的多种免疫细胞具有免疫调节功能(图21.2)。其中一个机制是通过分泌免疫调节因子。如Li等人研究所示,来自hAECs培养的条件培养基具有抑制体液和细胞介导的适应性免疫系统的细胞的能力,如T细胞和B细胞增殖的减少所示。各种可溶性因子被牵连,包括甲胎蛋白(AFP)、巨噬细胞抑制因子(MIF)、Fas配体,TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、TGF-β和人白细胞抗原-G(HLA-G)(图21.2)。研究表明,在MS动物模型中,hAECs产生AFP,AFP可降低淋巴细胞活性,减少神经炎症。此外,hAECs在其表面上以可溶性形式表达HLA-G。HLA-G是一种非经典的HLA-I类抗原,据信它能够保护发育中的胎儿免受母体免疫系统的侵害。HLA-G诱导CD8+T细胞凋亡,抑制CD4+T细胞的增殖。此外,体外共培养显示,hAECs可以显著抑制抗原特异性、异基因和有丝分裂原刺激的T细胞反应。现有的数据表明,hAECs的免疫调节和修复作用与巨噬细胞活性密切相关。在肺损伤模型中,给予博莱霉素引起损伤,hAECs是肺纤维化的有效刺激因子,可调节宿主的炎症反应,减少肺纤维化,防止肺功能的丧失。随后使用表面活性剂蛋白C敲除小鼠进行研究,这些小鼠由于巨噬细胞功能受损而极易受到肺损伤。结果发现,在博莱霉素损伤后,给予hAECs不能减少肺纤维化或改善肺功能。作者推测,hAECs不能发挥其修复作用的原因是正常宿主巨噬细胞功能的损害。此外,hAECs在体外和体内都直接影响巨噬细胞的行为,并且极化巨噬细胞趋向于修复前M2表型,并且这种极化在该肺纤维化模型中观察到的hAECs修复效果是至关重要的。同样,在一个模型中肝纤维化、移植的hAECs与巨噬细胞向M2表型的极化有关,M2表型与IL-10的增加和纤维化的减少有关。巨噬细胞在MS的病理生理学上具有双重作用。在与高水平的前炎症细胞因子相关的活动性MS病变中,经典激活或M1型巨噬细胞介导显著的细胞损伤。然而,另一种激活的M2型巨噬细胞可以是通用的,通过暴露于细胞因子如白细胞介素4和白细胞介素10,并参与细胞修复。虽然hAECs对EAE和MS中巨噬细胞极化的影响尚未直接研究,但慢性EAE中巨噬细胞浸润已显示减少。此外,在脊髓横断和脑出血的研究中发现,用hAECs治疗的动物胶质增生和小胶质细胞减少。此外,已经证明hAECs给药直接抑制宿主的免疫应答。在博来霉素肺纤维化模型中,hAECs给药显著降低了局部纤维化程度。通过降低TNF-α和IFN-γ的表达,促进肺的炎症反应。有趣的是,hAECs治疗也显著降低IL-6和TGF-β的表达,这两种细胞都能促进前炎症性Th17细胞的分化,在EAE和MS发病机制中起重要作用。在胎羊宫内炎症模型中,发现hAECs可减轻局部肺部炎症,同时观察到TNF-α、IL-1β和IL-6降低。此外,hAECs减少局部脑炎症,随后减少白色和灰质损伤。本实验室和其他方面的最新数据也提示,hAECs可以调节MS动物模型EAE的自身免疫应答。据报道,静脉注射hAECs可减少免疫细胞向中枢神经系统的浸润,从而减少这些动物的脱髓鞘。此外,作者推测,这种效应是由于Th2偏倚,部分可能是由TGF-β和PGE2介导的。其他免疫细胞对这种观察到的免疫调节的确切机制和贡献尚待阐明,但迄今为止的结果是有希望的,值得进一步研究。
图21.2hAECs具有免疫调节特性,已知hAECs可抑制多种免疫细胞功能,hAECs可抑制T细胞活化,浸润炎症组织,增加抗炎性Treg细胞的数量。hAECs还能减少巨噬细胞向炎症区域的浸润,并促进巨噬细胞向修复前M2表型的极化。这些免疫调节作用被认为是由于释放可溶性因子,包括PGE2、TGF-β、Fas-L、AFP、MIF、TRAIL和HLA-G。hAECs已被证明可以调节体内宿主的免疫系统,减少TNF-α生产、IFN-γ,MCP-1和IL-6和增加抗炎细胞因子IL-10和IL-4的生产。
hEACs的神经保护/再生能力干细胞具有通过旁分泌神经保护、血管生成和抗炎机制发挥作用的能力,同时表达具有刺激内源性祖细胞的潜力的神经营养因子和生存因子。鉴于中枢神经系统内缺乏足够的内源性修复,具有干细胞样特性的细胞疗法具有极大的兴趣,其可能取代和修复中枢神经系统的损伤。hAECs由来源于胚胎外胚层的羊膜细胞,在受精后8天和原肠形成之前,因此具有ESCs的许多特征。此外,hAECs还表达特征性ESC基因,包括POU5F1、SOX2、CFC1、NANOG、DPPA3、PROM1、PAX6和表面抗原SSEA-4和GCTM2,提示其具有多效性。此外,hAECs中未成熟和成熟神经抗原如巢蛋白和GFAP的mRNA表达及阳性免疫细胞学证据表明这些细胞易患分化为成熟的神经细胞。事实上,由hAECs球状结构组成的高密度培养物由于未成熟神经元和胶质细胞表面蛋白表达。在神经分化培养基中培养后,多数hAECs表达具有星形细胞形态的GFAP,少数表达NES或MAP2神经元标志物。
使用hAECs的体内研究已经证明,在异种移植后,细胞可以存活和功能至少4周,一些研究长达8周,而没有宿主免疫系统识别或排斥的证据。许多研究证实了hAECs对不同神经退行性疾病的治疗效果(总结在表21.1)。此外,这些研究还表明hAECs在体内具有分化潜能,在将hAECs移植到啮齿动物体内后,其表达神经标记物nestin、MAP2和GFAP。从大鼠中分离出hAECs,并显示在沙土鼠脑缺血模型中存活和表达MAP2。此外,在肌肉移植物内移植hAECs后,在大鼠脊髓损伤模型中可观察到明显的修复、再髓鞘化和脊髓电生理的改善。然而,作者不能识别任何神经元分化来解释这些信息。在另一个神经退行性模型中,Kakishita等人发现,由于hAECs移植,免疫抑制大鼠多巴胺耗竭的纹状体中阿朴吗啡诱导的旋转不对称性得到改善,但是发现细胞保留了圆形或椭圆形的形态而不是获得神经元形态。
表21.1hAECs治疗神经系统疾病疗效的临床前研究
在许多中枢神经系统损伤模型中,hAECs移植与改善临床上疾病的恢复有关,包括脑出血、脑缺血、脊髓横断、MPTP和6-OHDA诱导的毒性。这些作用似乎并不仅仅通过hAECs分化为神经元来解释,而是暗示hAECs产生神经营养因子,可以保护神经元和促进内源性修复。这种观察是由体外工作明确支持的。证明hAECs的条件培养基可以改善神经元存活和增加轴突生长。已知hAECs能产生多种不同的生长因子,具有促进神经再生的潜力。Uchidaet等的研究表明hAECs能产生BDNF和NT-3,这些因子对胚胎大鼠神经细胞培养中神经元存活和突起生长有部分作用。类似地,BDNF和NT-3在hAECs培养的条件培养基中被鉴定,并且表明这些因子可以改善神经干细胞的存活。然而,这些特定因素单独不如总hAECs条件培养基有效,表明其他重要因素尚未确定。
樱川等用hAECs条件培养基观察E18皮层神经元的存活增加,并得出结论,神经营养因子性质尚未可知,但可能具有与EGF类似的性质,因为这种细胞类型只对EGF作出反应,但hAECs似乎不表达EGFmRNA。相应地,文卡塔卡兰等发现hAECs条件培养基提高了鸡视网膜神经细胞的存活和分化,已知对FGF-2高度敏感,因此作者认为条件培养基中负责任的神经营养因子可能与FGF-2有关。然而,通过Westernblot检测已知的EGF和FGF-2亚型的hAECs条件培养基是阴性的。近年来,在条件培养基中鉴定出神经营养因子多效滋养素,并进一步证实多效滋养素在体外可促进UCB-MSC向多巴胺能(DA)神经元的分化。多效营养素在神经突起生长和迁移、祖细胞的修复和分化中起着多种作用。hAECs的神经营养作用可能是多种生长因子协同作用的结果,而不是孤立作用的结果。hAECs也被证明可以通过酪氨酸羟化酶产生儿茶酚胺,包括多巴胺和去甲肾上腺素。这一发现导致了大量的hAECs移植在帕金森病动物模型中的有益作用的研究,帕金森病是一种以DA神经元丧失为特征的神经变性疾病。总的来说,这些研究证实了生存率的提高。MPTP和6-OHDA大鼠脑内hAECs移植后,DA神经元与临床评分的都有所改善,但这些观察的机制仍然存在争议。hAECs可在体外分化为DA神经元,所观察到的体内改善似乎比预期的hAECs衍生DA神经元的有限存活更大。当在hAECs条件培养基中培养时,DA神经元的存活得到改善,神经营养因子的产生似乎是一个更合理的解释。尽管高剂量的儿茶酚胺明显具有神经毒性,但低剂量的儿茶酚胺已被证明能够保护神经元免受自由基诱导的氧化应激。此外,Noh等还证明了多巴胺在延长BDNF对神经元细胞死亡的神经保护作用方面的协同作用。
鉴于许多复发性缓解和进展型的MS患者缺乏成功的治疗方法,迫切需要开发治疗MS所涉及的多种病理的治疗方法。如本综述所述,免疫系统的参与是非常重要的,因此迄今为止都是主要目标。然而,目前的临床治疗,正如我们强调的那样,神经变性在疾病的发病机制中起着同样重要的作用,特别是在进展阶段。此外,这两个途径不独立地作用。最小化外围和中心(直接在中枢神经系统内)炎症,这可以间接保护中枢神经系统免受神经退行性变。因此,未来的治疗需要解决这两个组成部分。如表21.2所示,干细胞,尤其是hAECs,具有靶向和逆转多种病理途径的能力,这些途径有助于MS的发展和进展。例如,MS的病理后果包括增加T细胞活化,增加致病性Th1和Th17细胞的产生,以及很少或没有神经再生。相反,hAECs已被证明抑制T细胞活化,抑制Th1和Th17细胞的发育和炎症前体作用,并且还能分泌促进神经再生的神经营养因子,如BDNF、NGF和多效营养素。
hAECs有望成为治疗炎性和神经退行性疾病的辅助药物,仍然存在的一个重要问题是它们的安全性一旦移植到病人身上。研究表明,hAECs具有免疫特权和免疫抑制作用,因此在异基因环境中使用似乎是安全的。然而,HLA匹配的要求仍有待确定。在这方面,羊膜是值得注意的。这些hAECs已经使用了30多年来治疗几种临床疾病。这些包括硬脑膜缺损、角膜病变和结膜Bowens病等情况下的眼表重建,以及烧伤病变的治疗。在这些情况下,hAECs已被证明是耐受性良好的,没有形成肿瘤,并没有导致移植排斥反应。鉴于羊膜目前的安全性,很有可能在第一阶段临床试验中研究hAECs。然而,在试验开始之前,需要仔细评估与它们的免疫原性和其他因素相关的问题。鉴于hAECs移植物存活率在预免疫动物中显著减少,这一方面尤其相关。这在Gabler和Lohmann的研究中得到了说明,当羊膜连续移植到眼睛(这是免疫特权)产生炎症反应后,第二次和第三次移植。这些结果表明hAECs在移植环境中的持续免疫抑制和再生作用将需要克服几个免疫屏障。
尽管如此,临床前动物研究的结果提示,hAECs具有很强的免疫抑制作用,并可能诱导外周免疫耐受并逆转正在进行的炎症反应。此外,hAECs在体内保持分化为神经细胞的能力,现在相信这些细胞可以通过分泌大量神经营养因子来增强内源性神经再生。令人鼓舞的是,羊膜组织已被证明是有效和安全的临床应用组织。因此,hAECs从临床前阶段向临床设置的转变可能加速。然而,需要进一步的研究,了解潜在的机制,有助于它们的治疗潜力。总之,hAECs提供了一种新的有前途的细胞替代物,这种细胞替代物在治疗性移植所需的大量药物中容易获得,并且已被证明具有免疫调节、神经保护作用,并且这些特性使它们成为治疗神经退行性疾病的有吸引力的潜在细胞疗法,比如MS。
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